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详细的:高效液相色谱法及分离条件

更新时间:2018-05-25 14:09:32点击次数:316次字号:T|T
HPLC法中分离条件的选择 1.固定相与装柱方法的选择: 选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm); 首选化学键合相,匀浆法装柱; 2.流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相—甲醇,1mL/min; 3.柱温的选择: 选室温25℃左右; 各类高效液相色谱法 (一)液固吸附色谱法(LSC) 流动相为液体,固定相为固体吸附剂; 1.分离机制: 利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力差异; 分离前提: K不等或k...


HPLC法中分离条件的选择






1.固定相与装柱方法的选择:

选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm);

首选化学键合相,匀浆法装柱;

2.流动相及其流速的选择:

选粘度小、低流速的流动相—甲醇,1mL/min;

3.柱温的选择:

选室温25℃左右;


各类高效液相色谱法



()液固吸附色谱法(LSC

流动相为液体,固定相为固体吸附剂
1.分离机制:

利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力差异;
分离前提:

K不等或k不等;
2.固定相:

LC比,固定相粒径不同(<10μm);
3.流动相:

底剂(烷烃)+有机极性调节剂;
※例:正己烷或庚烷+氯仿。。。
4.影响K的因素:

与固定相性质和流动相性质有关;
溶质分子极性,洗脱能力k↑tR
溶剂系统极性,洗脱能力k↓tR
注:调节溶剂极性,可以控制组分的保留时间;
5.出柱顺序:

强极性组分后出柱,弱极性组分先出柱;
6.硅胶吸水量LSC→LLC
硅胶含水量较小,吸附色谱,硅胶极性较大;
硅胶含水量>17% ,分配色谱,硅胶失活载体;
吸附的水固定液
()-液分配色谱法(LLC
1.分离机制:

利用组分在两相中溶解度的差异
2.固定相:

载体+固定液(物理或机械涂渍法)
缺点:

系统内部压力大,易流失,不实用
固定液-极性→NLLC

固定液-非极性→RLLC
3.
①正相色谱-固定液极性>流动相极性(NLLC
极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱:适于分离极性组分;
②反相色谱-固定液极性<流动相极性(RLLC

极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱:适于分离非极性组分;
()化学键合相色谱法(BPC
1.化学键合相
(1)分离机制:

分配+吸附(以LLC为基础);
(2)特点:
1
)不易流失;
2
)热稳定性好;
3
)化学性能好;
4
)载样量大;
5
)适于梯度洗脱;
2.反相键合相色谱
(1)分离机制:

疏溶剂理论;
正相-流动相与溶质排斥力强,作用时间K↑,组分tR
反相-流动相与溶质排斥力弱,作用时间K↓,组分tR
(2)固定相:

极性小的烷基键合相;
C8
柱,C18柱(ODS-HPLC80%问题);
(3)流动相:

极性大的甲醇-水或乙腈-水;
流动相极性>固定相极性;
底剂+有机调节剂(极性调节剂);
例:水+甲醇,乙腈,THF
(4)流动相极性与k的关系:

流动相极性,洗脱能力k↑,组分tR
(5)出柱顺序:

极性大的组分先出柱;

极性小的组分后出柱;
(6)适用:

非极性~中等极性组分(HPLC 80%问题)

3.正相键合相色谱
(1)分离机制:

溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力
(2)固定相:

极性大的氰基或氨基键合相;
(3)流动相:

极性小(同LSC);底剂+有机极性调节剂;
例:正己烷+氯仿-甲醇,氯仿-乙醇;
(4)流动相极性与K的关系:
流动相极性,洗脱能力,组分tRk↓
(5)出柱顺序:

结构相近组分,极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱;
(6)适用:
氰基键合相与硅胶的柱选择性相似(极性稍小),分离物质也相似;
氨基键合相与硅胶性质差别大,碱性,分析极性大物质、糖类等;
4.离子对色谱和离子抑制色谱
反相离子对色谱法(IPCPIC
反相色谱中,在极性流动相中加入离子对试剂,使被测组分与其中的反离子形成中性离子对,增加KtR,以改善分离;
(1)离子对试剂:

烷基磺酸钠分析碱
四丁基季胺盐分析酸
(2)影响K的因素:
a
.与m的极性有关(同反相色谱);
b
.与R的链长有关:R↑长,极性小,tRk↑
(3)适用:

较强的有机酸、碱;

反相离子抑制色谱;
在反相色谱中,通过加入缓冲溶液调节流动相pH值,抑制;
组分解离,增加其KtR,以达到改善分离目的;
1)离子抑制剂:

弱酸、弱碱性物质;

pH一定的缓冲溶液;
2K的影响因素:

与流动相极性有关,还与pH值有关;
选择流动相:

应同时考虑极性及pH值;
酸性物质-加入酸HActRK↑
碱性物质-加入碱NH3·H2OtRK↑
调节pH范围:

3.0~8.0;
pH>8.0
破坏键合相与载体的结合;
pH<3.0
腐蚀柱子;
3)适用:

极弱酸碱物质;
pH=3~7
弱酸;

pH=7~8弱碱;

两性化合物;

色谱法


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